操作步骤如下：
1、用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现缺口 ， 露出黏性末端；
2、再用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端；
【基因表达载体构建步骤】3、将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处；
4、再使碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键；
5、再加入适量的DNA连接酶 ， 催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键 ， 从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子 。

以上就是基因表达载体构建步骤的内容啦，希望本文可以帮到你！

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